Вирусы гриппа – важные инфекционные агенты, являющиеся причиной острого респираторного заболевания, поражающего миллионы людей во всем мире. Грипп характеризуется не только большим количеством вызванных им осложнений, но и значительными экономическими убытками, которые он наносит. Кроме того, высокая переменчивость этих вирусов приводит к появлению все более опасных для жизни человека разновидностей. Гриппозная инфекция поддается достаточно эффективному контролю путем вакцинации и применению противовирусных препаратов. На данный момент для лечения гриппа утвержден только один класс вирусоспецифических препаратов: ингибиторы нейраминидазы. Вот почему существует необходимость разработки противовирусных лекарственных средств с новым механизмом действия. Одним из оригинальных противовирусных препаратов, хорошо зарекомендовавших себя в лечении гриппа и острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ), является Амизон (энисамиума йодид), который в настоящее время широко применяется в клинической практике стран СНГ.
Елена Говоркова, директор лаборатории в отделе инфекционных заболеваний Детского исследовательского госпиталя им. Св. Иуды (Мемфис, штат Теннесси, США) и специалист Американского национального центра по изучению и контролю гриппа.
На Третьем противовирусном конгрессе, который состоялся 12-14 октября 2014 г. в Амстердаме, были впервые представлены новые многообещающие результаты международных исследований Амизона. Учитывая большую актуальность темы противовирусной терапии, редакция «Еженедельника АПТЕКА» обратилась с просьбой прокомментировать новые данные, полученные в ходе исследований эффективности и профиля безопасности Амизона, к авторитетным ученым, принимавшим участие в данном мероприятии. Нашими собеседниками стали Елена Говоркова и Дэйвид Больц.
Елена Говоркова (Е.Г.) (MD, PhD) – директор лаборатории в отделе инфекционных заболеваний Детского исследовательского госпиталя им. Св. Иуды (Мемфис, штат Теннесси, США) и один из ведущих специалистов Американского национального центра по изучению и контролю гриппа. Ее научные интересы направлены на исследование эффективности препаратов против вирусов гриппа (включая высокопатогенные штаммы), а также на изучение молекулярно-биологических и генетических свойств резистентных вирусов. Е. Говоркова является автором свыше 110 оригинальных научных публикаций в ведущих международных журналах и обладателем нескольких американских и русских патентов. Является членом ряда научных обществ, а также редакционных советов журналов «Antiviral Research», «Antimicrobial Agents and Chemotherapy», «Vaccine, Journal of Infectious Diseases».
Дэйвид Больц (Д.Б.) (PhD) – научный сотрудник отдела микробиологии и молекулярной биологии НИИ Иллинойского технологического института (Чикаго, штат Иллинойс, США). Вот уже более 10 лет он занимается вопросами патогенеза вирусных заболеваний, доклиническими исследованиями антивирусной активности вакцин и химиотерапевтических препаратов. Является членом Американского общества вирусологов (American Society for Virology).
Дэйвид Больц, научный сотрудник отдела микробиологии и молекулярной биологии Иллинойского НИИ технологии (Чикаго, штат Иллинойс, США).
Е.Г.: Проблема лечения и профилактики гриппа и ОРВИ никогда не теряла свою актуальность, а после вспышек так называемого птичьего гриппа, пандемии свиного гриппа в 2009 г. стала еще более насущной. Это обусловлено как необходимостью поиска эффективной терапии при тяжелых случаях заболевания, так и возможностью возникновения резистентности вирусов к существующим лекарственным средствам. Например, эпидемические штаммы вируса гриппа А подтипов Н1N1 и H3N2 стали нечувствительными к препарату римантадин.
Разработка противовирусных препаратов ведется по нескольким перспективным направлениям. Это поиск препаратов с прямым действием на белки вируса гриппа (ингибиторы нейраминидазы, гемаглютинина, полимеразного комплекса). Это и препараты, защищающие клетки человека от вируса гриппа путем удаления рецепторов, к которым прикрепляется вирус. И, наконец, это лекарственные средства, способные активировать неспецифические механизмы противовирусной защиты (например, разные иммуномодуляторы).
При этом желательно, чтобы препараты имели дополнительные свойства, которые могут повлиять на процесс патогенеза вирусной инфекции. В частности, важна их противовоспалительная активность, поскольку воспаление играет значительную роль в развитии инфекционного процесса при гриппе и ОРВИ. Избыточные воспалительные реакции могут стать пусковым механизмом для развития осложнений и тяжелых форм этих заболеваний.
Безусловно, вакцинация доказала свою противоэпидемическую эффективность. Но и гриппозные вакцины имеют ряд недостатков: возможное несоответствие штаммового состава вакцины и актуальной разновидности вируса, а также значительный период, необходимый для разработки клинически доступной вакцины против нового вирусного штамма. Поэтому наряду с вакцинацией необходимо иметь возможность применения эффективных противовирусных средств для немедленного лечения инфекции.
На данный момент только один класс вирусоспецифических препаратов (а именно: ингибиторы нейраминидазы озельтамивир и занамивир) рекомендован для профилактики и лечения гриппа у взрослых и детей. Появление вирусов гриппа, резистентных к ингибиторам нейраминидазы, стало значительной проблемой системы здравоохранения. Высокая распространенность вирусов H1N1 с мутацией H275Y, которая обусловливает резистентность к ингибиторам нейраминидазы, была зафиксирована во всем мире во время сезонных эпидемий гриппа в 2007-2009 гг.
Другим моментом, ограничивающим применение ингибиторов нейраминидазы, является широкая циркуляция вирусной микст-инфекции, поскольку в этом случае необходимы препараты, которые эффективно действуют не только на вирусы гриппа, но и на другие вирусы, поражающие респираторный тракт. Кроме того, понятно, что следует разрабатывать и внедрять лекарственные средства с разными механизмами противогриппозного действия, а не только ингибиторы нейраминидазной активности. Тогда появится возможность применения комбинированной терапии и, потенциально, значительного снижения частоты осложнений при гриппозной инфекции.
Разработка и изучение нового лекарственного средства – сложный и многоступенчатый процесс. Потому, отвечая на данный вопрос, необходимо разделить доклиническую и клиническую стадии исследования. Доклиническая стадия проводится с использованием культуры клеток и на лабораторных животных. При проведении этих исследований следует оценить не только эффективность и профиль безопасности препарата, но и понять возможный механизм его действия. В культуре клеток определяют подавление специфической вирусной активности и снижение вирусных титров с установлением дозозависимого эффекта. В экспериментах на животных оценивают степень оказанной препаратом защиты от гриппозной инфекции.
На клинической стадии исследований наиболее важными остаются критерии оценки состояния пациента: выраженность основных клинических симптомов, продолжительность заболевания, наличие осложнений. Вместе с тем необходимо использовать и вирусологические критерии, которые позволяют оценивать уровень снижения репликации вируса в верхних дыхательных путях человека.
Ряд высокотехнологичных современных подходов применяется для установления механизма действия исследуемых препаратов. К ним относятся разные молекулярно-генетические методы, скрининг рецепторов, определение уровня цитокинов и хемокинов, а также анализ клеточных факторов.
Одним из многообещающих противовирусных препаратов для лечения гриппа и ОРВИ является Амизон. Амизон представляет собой оригинальное химическое соединение, относящееся к производным изоникотиновой кислоты. На Третьем противовирусном конгрессе, который состоялся 12-14 октября 2014 г. в Амстердаме (Нидерланды), Д. Больцем были представлены убедительные результаты противовирусной эффективности Амизона в отношении вирусов гриппа и некоторых других РНК-содержащих респираторных вирусов. По результатам проведенных клинических исследований в НИИ гриппа в Санкт-Петербурге, Амизон обнаруживает выраженный клинический эффект при гриппе и ОРВИ.
Таким образом, Амизон – это оригинальный препарат и до сих пор ни на рынке США, ни на рынках других экономически развитых стран химико-фармацевтических аналогов этого препарата нет.
Д.Б.: Мы исследовали противовирусную активность Амизона, точнее его активного вещества энисамиума йодида, против гриппа и респираторно-синцитиального вируса in vitro. Используя дифференцированные нормальные бронхоэпителиальные клетки человека (Normal Human Bronchial Epithelial Cells – NHBE), мы продемонстрировали, что энисамиум (Амизон) эффективно угнетает (более чем 100-кратно) репликацию разных подтипов вирусов гриппа типа А (H1N1, H1N1pdm09 и H3N2), а также гриппа типа B. Кроме того, энисамиум (Амизон) угнетал репликацию резистентного к озельтамивиру вируса гриппа А (H1N1) с мутацией H275Y. В дополнительных экспериментах, в которых энисамиум (Амизон) добавляли к клеткам NHBE через разные промежутки времени, влияя на разные стадии цикла репликации вируса гриппа, отмечено значительное снижение вирусных титров (p<0,05) в течение 8 ч. после инфицирования клеток. При добавлении энисамиума (Амизон) в течение первых 4 ч. после инфицирования зафиксировано снижение титра вируса более чем в 100 раз, что свидетельствует о влиянии энисамиума (Амизон) на начальной стадии репликации вируса гриппа.
Также установлено, что энисамиум (Амизон) эффективно угнетает репликацию респираторно-синцитиального вируса в клетках NHBE (более чем 100-кратно), что коррелирует со значительным снижением внутриклеточного уровня вирусного РНК.
Таким образом, энисамиум (Амизон) проявляет противовирусную активность против вирусов гриппа А и В in vitro, а также против респираторно-синцитиального вируса. На данный момент получены предварительные результаты, свидетельствующие о высокой противовирусной эффективности энисамиума (Амизон) также в отношении адено- и коронавирусов. Можно сделать вывод о том, что энисамиум (Амизон) может действовать как противовирусное средство широкого спектра действия, что может оказаться особо ценным в лечении при гриппе и ОРВИ.
ПОСЛЕСЛОВИЕ
На Третьем противовирусном конгрессе, который состоялся 12-14 октября 2014 г. в Амстердаме, американскими учеными были впервые представлены доказательства того, что Амизон проявляет противовирусную активность не только в отношении вирусов гриппа А и В, но также и респираторно-синцитиального вируса, который обусловливает тяжелые острые респираторные заболевания у детей. В рандомизированных плацебо-контролируемых клинических исследованиях, проведенных в НИИ гриппа в Санкт-Петербурге, было убедительно продемонстрировано, что Амизон имеет выраженную клиническую и противовирусную эффективность в отношении вирусов гриппа А (H1N1, H3N2) и В, парагриппа, аденовируса, респираторно-синцитиального вируса и отличается благоприятным профилем безопасности.
Вышеприведенные факты позволяют утверждать, что Амизон является эффективным противовирусным лекарственным средством с благоприятным профилем безопасности, показанным для применения при гриппе и ОРВИ.
Пресс-служба «Еженедельника АПТЕКА»
по материалам, предоставленным компанией «Фармак»
ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ ЭНИСАМИУМА [АМИЗОНА] В ОТНОШЕНИИ ВИРУСОВ ГРИППА В ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ НОРМАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ ЭПИТЕЛИЯ БРОНХОВ ЧЕЛОВЕКА*
Дэйвид Больц (David Boltz) 1, Синьцзян Пен (Xinjian Peng) 1, Мигель Муззио (Miguel Muzzio) 1, Прадйот Даш (Pradyot Dash) 2, Пол Томас (Paul Thomas) 2, Раджендра Мехта (Rajendra Mehta) 1 и Виктор Маргитич (Victor Margitich) 3
1Научно-исследовательский институт Иллинойского технологического Института (Illinois Institute of Technology (IIT) Research Institute), Чикаго, Иллинойс, США; 2Детский исследовательский госпиталь имени святого Иуды (St. Jude Children Research Hospital), Мемфис, Теннесси, США; 3ПАО «Фармак», Киев, Украина
ЭКСКУРС В ПРОБЛЕМУ
Грипп – это острое респираторное заболевание, вызываемое вирусами гриппа А и В, которые приводят к развитию ежегодных эпидемий с высоким уровнем заболеваемости и смертности, а иногда и пандемий. Хотя вакцины для профилактики гриппа доказали свою эффективность в уменьшении выраженности симптомов заболевания во время эпидемий гриппа, однако в связи с возможным антигенным несоответствием вакцины и относительно продолжительным процессом разработки клинически доступной вакцины против нового штамма вируса создание эффективных противовирусных препаратов для угнетения инфекционного процесса при гриппе является актуальной задачей. На данный момент только один класс противовирусных препаратов (ингибиторы нейраминидазы, такие как озельтамивир [Tamiflu®, «Roche»] и занамивир [Relenza®, «GlaxoSmithKline»]) рекомендован для использования с целью профилактики и лечения гриппа у взрослых и детей во всем мире.
Химическая структура энисамиума йодида
Сегодня значительные усилия сосредоточены на разработке новых способов лечения и выборе мишеней для действия лекарственных средств, которые дали бы возможность устранить патогенные свойства вируса гриппа. В этом контексте привлекают внимание некоторые препараты, которые на данный момент находятся на рынке стран СНГ и обнаруживают противовирусную активность в отношении вирусов гриппа А и В. Одним из таких препаратов является энисамиума йодид, который зарегистрирован и маркетируется под торговым названием Амизон® в Украине, России, Белоруссии, Казахстане и Узбекистане как противовирусное средство против гриппа.
Клинические исследования, проведенные в России, продемонстрировали высокую эффективность препарата против вирусов гриппа А и В, что позволило говорить о энисамиуме как о перспективном средстве, предназначенном для лечения гриппа. Однако имеющихся экспериментальных данных об эффективности этой производной изоникотиновой кислоты как противовирусного агента, действенного в отношении гриппа, недостаточно. Поэтому целью данного исследования было оценить ожидаемую противовирусную активность энисамиума в отношении вирусов гриппа in vitro. Пилотные исследования на MDCK- и A549-клетках продемонстрировали низкую проницаемость энисамиума – на уровне 0,08 и 0,87 %, соответственно, а также отсутствие противовирусного эффекта. Поглощение энисамиума дифференцированными нормальными бронхоэпителиальными клетками человека (normal human bronchial epithelial – NHBE) было лучшим в сравнении с клетками A549 и MDCK и варьировало в пределах 1,7-2,1 %. Поэтому именно культуры клеток NHBE были избраны для оценки эффективности и наличия противовирусного эффекта энисамиума в отношении вирусов гриппа.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культура клеток: в исследовании были использованы дифференцированные клетки NHBE EpiAirway System компании «MatTek» (Ашланд, Массачусетс, США). Клетки от одного донора были использованы для анализа однородности. Апикальную поверхность клеток подвергали влиянию влажного 95 % воздуха/5 % CO2, а также меняли среду и отмывали муцин каждые 24-48 ч.
Исследуемые материалы: исследованный продукт – энисамиум (Амизон®), был предоставлен ПАО «Фармак». Препарат для положительного контроля – озельтамивира карбоксилат, полученный от «Toronto Research Chemicals, TRC» (Торонто, Канада).
Вирусный агент: в NHBE-клетки были инокулированы вирусы гриппа А через апикальную поверхность. После инкубации в течение 1 ч. вирусные инокулят удаляли из клеток, апикальную поверхность клеток промывали натрий-фосфатным буферным раствором (Phosphate Buffered Saline — PBS).
Введение исследуемого материала: для проведения положительного контроля (использование озельтамивира карбоксилата) культура клеток NHBE инкубировалась с базальной стороны с озельтамивиром в течение 60 мин. до заражения вирусом. Энисамиум или контроль добавлялся к базальному компартменту культуры клеток до или после инокуляции и инкубировался в течение определенного условиями эксперимента периода.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Таблица 1. Противовирусная активность энисамиума в отношении вирусов гриппа А и В в культуре дифференцированных NHBE-клеток
aNHBE-клетки инокулированы вирусами гриппа в таком количестве, что показатель множественности инфекции (multiplicity of infection — MOI) составлял 0,01 PFU/клетку (PFU — plaque-forming unit, бляшкообразующая единица – отдельная инфекционная вирусная доля в суспензии вирусов, которую обнаруживают по образованию бляшки). После адсорбции в течение 1 ч. энисамиум добавлялся к базальному компартменту в указанной дозе и инкубировался в течение 24 ч. при 37 °С в среде с содержанием CO2 на уровне 5 %. Вирусы, высвобождавшиеся с апикальной стороны NHBE-клеток, собирали через 24 ч. после инокуляции.
bКонцентрация озельтамивира карбоксилата составляла 1 µM.
сТитры вирусов определялись в MDCK-клетках при помощи TCID50 анализа и выражались в log10TCID50/мл. Разность средних титров вируса (выраженных как log10TCID50/мл) между инфицированными вирусом необработанными препаратом и обработанными энисамиумом NHBE-клетками указана в круглых скобках.
Таблица 2. Проницаемость энисамиума в дифференцированные клетки NHBE
aЭнисамиум в указанных дозах инкубировали с дифференцированными NHBE-клетками при 37 °С в атмосфере с содержанием СО2 на уровне 5 % в течение 24 ч. в среде для роста бронхиальных эпителиальных клеток, не содержащей сыворотку (serum-free Bronchial Epithelial Cell Growth Medium).
bКоличество повторений эксперимента.
сКлеточные экстракты собирали и определяли концентрацию энисамиума при помощи LC-MS-MS. Концентрация выражалась в нг на 106 клеток.
Ингибиторная активность энисамиума в отношении разных MOI вируса гриппа A/Brisbane/59/2007 (H1N1)
Дифференцированные NHBE-клетки были инфицированы вирусом гриппа A/Brisbane/59/2007 (H1N1) в количестве MOI=0,01 PFU/клетку (A), 0,001 PFU/клетку (B) и 0,0001 PFU/клетку (C). Энисамиум (1000; 500; 100; 50 и 10 µM) добавляли к базальному компартменту через 1 ч. после инокуляции вируса. Смывы с апикальной поверхности клеток собирали через 24 ч. (черные кружки) и 48 ч. (черные квадраты) после заражения и титровали с помощью TCID50-анализа. Межевое значение, которое определяли в ходе анализа, составило 0,75 log10TCID50/мл.
Кинетика внутриклеточного поглощения энисамиума
Неинфицированные NHBE-клетки обрабатывали 1000 µM энисамиума, затем клетки отбирали через 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8 и 24 ч. после контакта с исследуемым веществом. Представлены концентрации энисамиума в клетках.
Эффективность ингибирования репликации вируса гриппа в NHBE-клетках энисамиумом в зависимости от времени его добавления
Дифференцированные NHBE-клетки были инфицированы вирусом гриппа A/Brisbane/59/2007 (H1N1) в количестве MOI=1,0 PFU/клетку и экспонировались с энисамиумом 2000 µM. Энисамиум добавляли в базальный компартмент через -1, 0, 2, 4, 6, 8 и 10 ч. после инокуляции вируса и оставляли в течение 24 ч. Время инокуляции вируса указывается как 0 часов. Супернатанты собирали через 24 ч. после заражения с верхнего отсека и титровали при помощи TCID50-анализа (A). Экспрессия матричного гена (Matrix gene – M gene) связана с контролем уровня вируса, экспрессия гена была нормирована по уровню мРНК β-актина в соответствующем образце (B).
Эффект предварительной инкубации NHBE-клеток с энисамиумом перед инокуляцией вируса
Дифференцированные NHBE-клетки были предварительно обработаны энисамиумом 1000, 500, 100 µM за 24 ч. до инокуляции. Через 24 ч. к NHBE-клеткам был инокулирован вирус гриппа A/Brisbane/59/2007 (H1N1) в количестве MOI=0,001 PFU/клетку; энисамиум находился в культуральной среде с базальной стороны в течение всего эксперимента. Озельтамивира карбоксилат (1 µM) был добавлен к базальному компартменту за 1 ч. до инокуляции вируса, он находился там в течение всего эксперимента. Время инокуляции вируса указывается как 0 часов. Супернатанты собирали через 24 ч. (черные столбики) и 48 ч. (белые столбики) после инфицирования.
ЗАКЛЮЧЕНИЯ
Выявлена противовирусная активность противогриппозного соединения – энисамиума, которая подтверждает данные о его клинической эффективности. Хотя молекулярный механизм действия энисамиума до сих пор до конца не идентифицирован, данные, представленные выше, указывают на то, что энисамиум влияет на вирусную репликацию вирусов гриппа. В случае, когда энисамиум добавляли перед или вскоре после инфицирования, снижение экспрессии матричного гена и вирусных титров указывает на то, что энисамиум ингибирует синтез вирусной РНК. Интересно, что вирусные титры продолжали повышаться в присутствии энисамиума. Поэтому можно сделать вывод, что энисамиум угнетает репликацию вируса гриппа, но не блокирует ее полностью. Необходимы дальнейшие исследования для обеспечения лучшего понимания механизма действия энисамиума.
Благодарность. Данная работа финансировалась ПАО «Фармак». Мы выражаем глубокую благодарность доктору Джону Морри (John Morrey), Дональду Сми (Donald Smee) и Елене Говорковой (Elena A. Govorkova) за ценные советы и полезные обсуждения в ходе этих исследований.
___________________
* Перевод постера, представленного на Третьем противовирусном конгрессе, который состоялся 12-14 октября 2014 г. в Амстердаме
