Зміна професії

Їхня ідея полягає в тому, що потрібно змусити фібробласти поміняти спеціалізацію — «перетворитися» на клітини серцевого м’яза. Іншими словами, «перемотати назад» зміни, що відбулися після інфаркту.

З погляду фундаментальної науки місія є цілком здійсненною. Клітини нашого організму можуть сильно відрізняться як виглядом, так і завданнями, які вони виконують. Наприклад, м’язова клітина в нашому біцепсі має скорочуватися, а нервова клітина — передавати нервові імпульси. Але, попри це, у кожній із них міститься абсолютно однаковий набір генів.

Клітини відрізняються, тому що в різних видах активовані різні гени (всі інші гени водночас нікуди не діваються, але вони «сплять», оскільки не потрібні клітині для виконання її специфічної роботи). Вчені вже вміють «вмикати» та «вимикати» потрібні гени, щоб перетворювати клітини одного різновиду на клітини іншого, або ж взагалі в неспеціалізовані — ті самі стовбурові клітини. З них потім можна «виростити» клітину будь-якої «професії». За роботи в цьому напрямі японський дослідник Яманака Сін’я у 2012 році отримав Нобелівську премію в галузі фізіології або медицини.

Але якщо говорити про конкретне завдання, коли потрібно «перетворити» клітини сполучної тканини людини на кардіоміоцити, та ще й зробити це не «в пробірці», а в організмі живої людини, то такого в усьому світі, як запевняє Оксана Півень, ще не робив ніхто. Готового рецепта виконання таких завдань немає — його потрібно створити, і зазвичай це робиться способом спроб і помилок.

П’ять елементів

Дослідники з ІМБіГ зараз працюють із клітинною культурою щурів. Простими словами, у них у чашці Петрі є щурячі ембріональні фібробласти, які потрібно «перетворити» на кардіоміоцити. Для цього потрібно «розбудити» п’ять абсолютно конкретних генів, відомих фахівцям під іменами GATA4, MyoD, Tbx5, Mef2c та HAND2. Кожен із них вміщує цілий каскад інших генів і тоді клітина стає кардіоміоцитом і виконує всі властиві йому функції.

Є кілька різних способів «увімкнути» потрібні гени. Кожен має свої переваги та недоліки, наприклад, може в майбутньому викликати рак (якщо йдеться про роботу з організмом тварини або людини). Наші дослідники для цього вирішили використовувати систему CRISPR/Cas9, за межами професійної спільноти добре відому під назвою «генетичні ножиці».

Вона й справді часто використовується в найрізноманітніших експериментах для того, щоб розрізати молекулу ДНК саме в тому місці, де потрібно досліднику. Але в нашій ситуації використовується інша її модифікація, яка нічого не ріже (і не потрібно), а знаходить конкретний ген, приєднується до нього та «вмикає» його.

Нашим вченим вдалося налаштувати цю молекулярну систему так, щоб вона вмикала ті самі п’ять генів у клітинах щурячих фібробластів. Внаслідок цього в клітинах дійсно стали працювати різні гени, характерні саме для кардіоміоцитів. Це гарні новини — процес «перетворення» почався. Але проблема в тому, що клітини досі не здатні скорочуватися, як це роблять справжні кардіоміоцити.

Зараз вчені намагаються зрозуміти, чому цього не відбувається. Найближчим часом вони хочуть додати до хімічного коктейлю деякі речовини, які можуть змусити клітини ще більше розлучитися з їхньою фібробластною спеціалізацією. Вийде чи ні — буде зрозуміло тільки за результатами експерименту.

Від щура до людини

Паралельно група Оксани Півень почала працювати над другим етапом великого завдання. Тут уже пройдений шлях потрібно повторити на культурі людських клітин. Це означає, що потрібно по-новому налаштувати молекулярну систему CRISPR/Cas9, оскільки її «щурячий» варіант відрізняється від «людського» для чотирьох генів із п’яти.

Спочатку вирішили працювати зі стовбуровими клітинами пуповини (ні, це не абортивний матеріал, все робиться легально й етично — за згодою породіль). Коли на цьому етапі все пройде успішно, вчені перейдуть уже до експериментів на складнішому «матеріалі» — фібробластах дорослого людського організму.

Можна не сумніватися, що підсумком усієї цієї роботи стануть цінні наукові результати, які автори опублікують в одному з міжнародних спеціалізованих журналів. Складніше питання в тому, чи допоможуть ці дослідження лікувати людей від наслідків інфаркту міокарда. Якщо бути гранично точним і чесним, то відповіді на нього не знає ніхто. Все з тієї самої причини — це нова галузь досліджень і всіх труднощів на цьому шляху передбачити неможливо. Цілком може виявитися, що деякі з них сьогодні неможливо розв’язати. Це абсолютно типова ситуація для наукової роботи.

А оптимістичний сценарій може бути таким. Після успішного «перетворення» в чашці Петрі щурячих фібробластів на кардіоміоцити потрібно зробити все те саме, тільки вже в організмі лабораторного пацюка, якого перед цим «змусять» пережити інфаркт.

Якщо й тут усе пройде вдало, то такий самий експеримент потрібно повторити вже на тваринах, чий організм більше схожий на людський. Найімовірніше, на свинях. Це називається доклінічні дослідження. І тільки після цього настане черга клінічних досліджень, тобто вже на людях. Спочатку потрібно переконатися в тому, чи не шкодить таке «лікування», а вже потім — чи лікує воно.

«Наскільки я можу прогнозувати, найгірше, що може статися з пацієнтом внаслідок такої терапії — це нічого, — каже Оксана Півень. — Просто все залишиться як є, але зашкодити людині це не зможе».

Всі ці етапи дослідження можна провести в Україні, хоча для цього, безумовно, потрібне фінансування, з яким наші вчені завжди мають труднощі. Але це вже окрема історія. Навіть за умови найбільш оптимістичного сценарію клінічне застосування нової медичної технології стане можливим не раніше, ніж через кілька років.

Це гриб

Пневмонії бувають дуже різні. Бувають звичайні, викликані звичайними бактеріями — пневмококами. У такому разі вони лікуються вдома звичайними антибіотиками й через три тижні людина практично здорова.

А бувають пневмонії атипові — їх викликають атипові збудники, як-от, наприклад, деякі коронавіруси. Але не тільки вони — той самий вірус грипу, вірус кору, мікоплазми, клебсієли та багато інших. Такі пневмонії, як тепер ми знаємо, можуть бути дуже підступними й навіть смертельними. На щастя, далеко не завжди.

Серед атипових збудників є один, про який більшість людей, якщо вони не медики, не чули й не стикалися з ним.

Його наукова назва — Pneumocystis jirovecii та викликає він так звану пневмоцистну пневмонію. Це проблема, з якою насамперед стикаються хворі на СНІД, а також на онкогематологічні захворювання, та пацієнти після трансплантації органів. Якщо ви не входите до групи ризику, то можете бути впевнені на всі 100%, що не захворієте.

Вчені довго сперечалися щодо систематичної належності збудника пневмоцистної пневмонії, поки не дійшли висновку, що він належить до грибів. Це важливий момент, оскільки те, що для нас просто «мікроб», насправді може бути вірусом, бактерією (які теж різні бувають), найпростішим (багато з яких належать до тварин) або грибом. А це означає, що хвороби, викликані такими збудниками, лікуються зовсім по-різному (всі ж знають, що антибіотики під час грипу не тільки не допомагають, але й можуть викликати ще більші проблеми).

Так само й зі збудником пневмоцистної пневмонії. Звичайні антибіотики, якими лікують звичайне запалення легенів, на нього не діють. Хоча вже давно є препарати, які непогано справляються з цим грибком. Загалом, вилікувати це захворювання можна, хоча там є свої труднощі. Але для цього його спочатку потрібно діагностувати. А ось тут — все непросто.

Труднощі діагностики

Клінічна картина в такої пневмонії має свої особливості, але її цілком можна сплутати з деякими іншими різновидами пневмонії. Рентгенівський знімок або результати комп’ютерної томографії можуть допомогти, але теж не гарантують правильного діагнозу. А для того, щоб лікувати пневмоцистну пневмонію, її потрібно діагностувати абсолютно впевнено й розуміти, що це саме вона, а не якась інша.

Якби це була бактерія — її можна культивувати в спеціальному середовищі, як це зазвичай роблять із різними хвороботворними бактеріями, щоб визначити їхню видову належність і чутливість до антибіотиків. Але цей гриб відмовляється рости в чашці Петрі.

Щоб визначити пневмоцисту, на озброєнні нашої медицини є мікроскопічний метод. Це означає, що зразок мокроти пацієнта поміщають під мікроскоп і дивляться, які мікроорганізми видно. Іноді пневмоцисту дійсно вдається розглянути, але дуже часто — не вдається, попри те, що саме вона є причиною хвороби. У таких ситуаціях кажуть, що метод має низьку чутливість.

Тому на практиці часто трапляється так, що від пневмоцисти пацієнтів починають лікувати вже тоді, коли лікування звичайної пневмонії не привело до позитивної динаміки. Часто таке лікування починається занадто пізно. За деякими оцінками (офіційно такої статистики немає) приблизно 10% хворих на СНІД в Україні помирають від пневмоцистної пневмонії.

А як же ПЛР?

Метод полімеразної ланцюгової реакції, про який так багато говорять останнім часом, давно став «золотим стандартом» під час виявлення найрізноманітніших збудників хвороб. За фрагментом генетичного матеріалу він дає змогу з великою точністю сказати, чи є в організмі людини, наприклад, вірус гепатиту C, збудник герпесу, вірус папіломи або, нарешті, SARS-CoV-2. Тест-системи на базі ПЛР широко використовують у великій кількості лабораторій.

Чому б за допомогою цього методу не діагностувати пневмоцистну пневмонію? Саме так і роблять у багатьох країнах. Але не в нас.

Приблизно 4 роки тому до Олени Мошинець, кандидатки біологічних наук і старшої наукової працівниці Інституту молекулярної біології й генетики (ІМБіГ) звернулися мікробіологи-клініцисти з одного медичного центру, де лікують хворих на СНІД. Вони попросили розробити таку тест-систему, щоб вчасно діагностувати й лікувати пацієнтів із пневмоцистною пневмонією.

Варіант купити тест-систему імпортного виробництва не розглядався. Проблема навіть не у вартості, а в тому, що їх взагалі не було на ринку (принаймні тієї миті). У розвинених країнах лікувальні заклади, яким часто доводиться діагностувати пневмоцистну пневмонію, виробляють такі тест-системи власними силами для себе самих або замовляють в інших наукових установах, які таке замовлення готові виконати. Комерційного продукту не було, найімовірніше, тому що для бізнесу він не уособлював особливого зиску. Іншими словами, навіть за кордоном не можна піти в аптеку, онлайн-магазин чи на склад і купити таку тест-систему.

Метод ПЛР дуже добре знайомий молекулярним біологам і генетикам, які постійно використовують його для своїх найрізноманітніших дослідницьких завдань. Тому група Олени Мошинець вирішила розпочати роботу над цим завданням. Фінансування на реактиви, витратні матеріали та зарплату для колективу із шести осіб вдалося знайти за однією із програм Національної академії наук України — 200 тисяч гривень.

Трохи менш ніж через рік тест-система була створена. Восени 2016 року її перевірили на пацієнтах у Київському міському центрі профілактики та боротьби зі СНІДом на базі Київської міської клінічної лікарні №5. Виявилося, що вона доволі чутлива — добре «бачила» пневмоцисту в тих зразках, де методами мікроскопії її знайти не вдалося.

Некомерційний діагноз

Щоб легально застосовувати таку тест-систему, вона має пройти сертифікацію згідно з чинним законодавством. Олена Мошинець звернулася до однієї з юридичних фірм, де порахували, що з урахуванням усіх знижок (як для некомерційної структури) юридичний супровід цієї процедури буде коштувати приблизно стільки ж, як і саме розроблення тест-системи — приблизно 200 тисяч гривень.

Абсолютно зайвим буде говорити, що цю статтю витрат НАНУ дозволити собі не могла (тут взагалі варто нагадати, що першочерговим завданням НАНУ не мають бути такі розробки прикладного характеру, але це окрема розмова).

Творці тест-системи намагалися знайти спонсорів або інвесторів, готових профінансувати її сертифікацію, але безуспішно. Причина в тому, що вона мало кому цікава: порівняно здоровій людині пневмоциста ніяк не загрожує, а страждають через неї, насамперед, представники соціально незахищених верств суспільства (чи багато на них заробиш?).

За наступні роки ситуація не змінилася. Точно й швидко визначити пневмоцисту в нашій країні сьогодні не можна ні в державному медзакладі, ні в кваліфікованій комерційній лабораторії.

«Тест є, проблема є, розв’язання поки не видно», — підсумовує Олена Мошинець.

Час від часу до неї в індивідуальному порядку звертаються лікарі з комерційних клінік із проханням визначити пневмоцисту в біологічному зразку пацієнта. Технічно — це не складно. А юридично — ніяк не можна. Олена Мошинець стверджує, що вона не має особистого комерційного зиску в цій розробці. Але, звичайно, як її автор вона досі сподівається, що знайдеться хтось, хто допоможе втілити в життя цей соціально значущий проєкт.

Вправи з ядрами

З наукового погляду ця назва, звичайно, неправильна й дослідники не використовують її всерйоз. Але для того, щоб такі діти народилися, крім мами й тата, дійсно потрібна ще одна жінка, від якої дитина успадкує 37 генів на додачу до багатьох тисяч від справжніх батьків. Хоча ці 37 дуже важливі для нашого організму, вони прямо не вплинуть на колір очей, характер і здатність грати в шахи.

Історію появи таких дітей в Україні можна почати з 2014 року. Тоді в клініці, де працює Павло Мазур, вирішили створити нову технологію, щоб розв’язати проблему вікового безпліддя. Біологічні закони такі, що приблизно у 37 років у жінки починає різко знижуватися здатність зачати дитину навіть за допомогою допоміжних репродуктивних технологій. Після 40 це зробити дуже складно, хоча, досі можливо й можна знайти безліч позитивних прикладів. Але зазвичай для цього потрібні величезні зусилля й навіть вони нічого не гарантують.

У наших дослідників виникла гіпотеза, яку дуже спрощено можна сформулювати ось як. Проблема жінок старшого віку в тому, що їхні ооцити (це жіночі статеві клітини, які часто помилково називають яйцеклітинами), мають цитоплазму «стару» — саме вона винна в їхньому безплідді.

Тут доведеться пригадати шкільне заняття, де вивчали будову клітини. Для нас поки досить розуміти, що клітина (зокрема й ооцит) має ядро з ДНК (тими самими генами, де вся-вся інформація про наш організм) і цитоплазмою. Цитоплазма — це «внутрішній океан» клітини — все, що оточує ядро. У цьому океані є безліч різних органел, які щосекунди роблять неймовірні операції, без яких немає життя в найбільш прямому сенсі цього слова. Єдина органела, яку нам потрібно знати для цієї історії — мітохондрія, але до неї ми повернемося пізніше.

Щоб розв’язати проблему — допустили наші дослідники, — потрібно «стару» цитоплазму замінити «молодою». Для цього потрібен донор — молода жінка з гарним репродуктивним здоров’ям, яка пожертвує свій ооцит, який ще не встиг дозріти. З нього вчені приберуть ядро з генами й замінять його ядром (тобто генами) старшої жінки, яка хоче стати мамою. Такі операції називають «ядерними перенесеннями». Внаслідок усіх цих складних маніпуляцій у нас вийде ооцит зі «старими» генами майбутньої мами й «молодою» цитоплазмою донора. А далі — все по стандарту, добре знайомому будь-якому досвідченому ембріологові.

Але гіпотеза не підтвердилася. Експерименти показали, що «омолодження» цитоплазми ніяк не допомагає жінкам старшого віку мати дітей. Крім того, якщо в ооцити старших пацієнток підсадити молоді донорські ядра — все працює добре й можна отримати ембріони, які будуть нормально розвиватися. Отже, проблема вікового безпліддя зовсім не в «солідному віці» цитоплазми.

У науці, як відомо, негативний результат — це теж результат. Але чи можна ту техніку, яку відпрацював Павло Мазур, застосувати для отримання позитивного результату?

Є категорія пацієнток, які не можуть зачати дітей саме через проблеми, пов’язані з цитоплазмою. Як уже говорилося, їх приблизно до 3% з-поміж молодих жінок, які звертаються до клінік репродуктивної медицини. З біологічного погляду ці проблеми мають різну природу — у деяких ситуаціях наука розуміє їхній механізм, а в інших — ні, але зрозуміло, що якось він пов’язаний саме з цитоплазмою.

— У нас у клініці була відпрацьована методика, у нас були витратні матеріали, голки, реактиви, піпетки, середовища — вся база, потрібна для майже будь-яких ядерних перенесень. Чому б не спробувати? — розповідає Павло Мазур. — Ми спробували, і в нас вийшло!

На початку 2017 року на світ з’явилася здорова дитина після процедури ядерного перенесення — перша в Україні та друга у світі. Роком раніше в Мексиці народилася перша в історії дитина після операції ядерного перенесення, яка була проведена за трохи іншою методикою, ніж використовували українські дослідники.

Разом із донорською цитоплазмою такі діти отримують ті самі мітохондрії, про які ми вже згадували. На відміну від будь-яких інших органел, вони мають свої власні гени (ті самі 37) — цього разу не мамині, як у будь-кого з нас, а успадковані від іншої жінки — донора або, якщо хочете, «третього батька».

Гордість і здивування

Наука в Україні (зокрема й медична) досі виживає й дає свої результати «не завдяки, а всупереч». Що стосується впровадження наукових результатів у практику, то тут усе ще сумніше. А в цій історії виходить, що український дослідник разом зі своїми колегами випередив весь (майже весь) світ і отримав абсолютно реальні результати, які агукають, повзають, потім стають на ноги, говорять різні слова й майже точно (якщо захочуть) колись матимуть власних здорових дітей.

Як каже Павло Мазур, для такої роботи в ембріолога мають бути «рівні руки». Немає сумнівів у тому, що саме завдяки таким його рукам (а тепер уже й рукам інших його колег) в Україні народжуються «діти від трьох батьків». Але це ще не все. Допоміжна репродуктивна медицина, як і будь-яка інша, регламентується законами, які можуть відрізнятися в різних країнах — десь вони більш консервативні, а десь — менш. У якійсь країні ви можете вибрати стать майбутньої дитини, а в іншій — ні. Десь ВІЛ-позитивний чоловік не може стати донором сперми, а десь — будь ласка (ні, це не є небезпечно, якщо все робити правильно).

У США, наприклад, на початку «нульових» проводилися експерименти з ядерного перенесення. Але після того, як вони виявилися невдалими, FDA (Управління із санітарного нагляду за якістю харчових продуктів і медикаментів) заборонило проводити такі дослідження.

А у Великобританії, наприклад, ядерні перенесення дозволені з 2015 року, але поки що, наскільки відомо, жодна дитина після такої процедури там не народилася.

В Україні використання таких методик не заборонено, тому в нас абсолютно законно народилося вже 12 дітей, у яких, крім маминих і татових, є гени третьої людини. Більшість із них — завдяки рукам Павла Мазура.

Крім України й Мексики, «дитина від трьох батьків» торік з’явилася на світ у Греції.

А двоє «татів»?

У всій цій історії найважливіше, звичайно, не те, що у якогось хлопчика чи дівчинки є «третій батько». А те, що чоловік і жінка, які раніше не могли мати біологічних дітей навіть за всі гроші світу, тепер таку можливість отримали. Так, поки що, не в усіх країнах і, поки що, загальна кількість таких дітей дуже мала, як порівняти з потребою. Але це тільки початок і згодом ядерні перенесення будуть дедалі частіше застосовуватися в репродуктивній медицині. Можливо, навіть, з їхньою допомогою одностатеві пари зможуть мати дітей.

Павло Мазур каже, що вже сьогодні з таким питанням звертаються лесбійські пари. Вони хочуть, щоб одна із жінок дала свій «ядерний матеріал» (власне, стала матір’ю), а інша — цитоплазму разом із мітохондріальними генами. Ще потрібен чоловік і так вони зможуть народити дитину, яка успадкує гени обох жінок. Технічно, як ми знаємо, це можливо. Але юридично — ні, оскільки такі процедури в нас робляться тільки за суворими медичними показаннями. Якщо жодна із жінок не страждає на абсолютне безпліддя, то таких показань немає.

Якщо не брати до уваги питання етики, то чи можна в один ооцит помістити одночасно два жіночі ядра, або два чоловічі?

— Можна! — впевнено каже Павло Мазур. — Але дитини від цього не буде.

Річ у тім, що материнська та батьківська ДНК відрізняються спеціальними «позначками», а це означає, що ембріон навіть не почне розвиватися.

Але вже сьогодні на лабораторних мишах проводяться експерименти, щоб отримати потомство від одностатевих пар. Успіхи є і, цілком можливо, що через кілька років технічно це буде можливо і для людей. Очевидно, що етична сторона питання нікуди не дінеться, але це вже окрема історія.